A inibição não-competitiva é um tipo de inibição enzimática na qual o inibidor reduz a atividade da enzima e pode ligar-se à enzima tanto se esta já estiver ligada ao substrato como se não. Isto é diferente da inibição competitiva, na qual a afinidade de ligação ao substrato da enzima diminui na presença de um inibidor. Ainda que o inibidor possa ligar-se à enzima tanto se o substrato já estiver ligado à enzima como se não, quando tem uma maior afinidade para se ligar à enzima num desses estados, é denominado inibidor misto.
História Leonor Michaelis, durante os anos em que trabalhou como médico, e o seu amigo Peter Rona construíram um laboratório compacto no seu hospital e, no decurso de cinco anos, Michaelis (cujo sobrenome se tornou sinónimo de cinética enzimática) fez 100 publicações. Durante as suas investigações no hospital, foi o primeiro a perceber os diferentes tipos de inibição; concretamente usando frutose e glicose como inibidores da atividade da maltase. A maltase quebra a maltose em duas unidades de glicose. As descobertas conseguidas nesta experiência serviram para ver a diferença entre a inibição não-competitiva e a competitiva. A inibição não-competitiva afeta o valor da kcat (mas não a Km) nos gráficos; este inibidor liga-se a um local que tem especificidade por certa molécula. Michaelis determinou que, quando o inibidor se liga, a enzima fica inativada. Tal como muitos outros cientistas do seu tempo, Leonor Michaelis e Maud Menten trabalharam na reação que era usada para mudar a composição da sacarose e a lisava dando dois produtos: frutose e glicose. A enzima implicada nesta reação chama-se invertase, e é a enzima cuja cinética viria a ser revolucionária para explicar a cinética de outras enzimas. Quando expressavam a velocidade da reação estudada, derivaram uma equação que descrevia a velocidade de uma maneira que sugeria que dependia principalmente da concentração da enzima, bem como da presença do substrato, mas apenas até certo ponto. Adrian John Brown e Victor Henri lançaram as bases para a descoberta da cinética enzimática pela qual são conhecidos Michaelis e Menten. Brown concebeu teoricamente o mecanismo agora aceito para a cinética enzimática, mas não tinha dados quantitativos para o proclamar. Victor Henri fez contribuições significativas para a cinética enzimática durante a sua tese de doutoramento, embora não tivessem assinalado a importância das concentrações de ião hidrogénio e a mutarrotação da glicose. O objetivo da tese de Henri era comparar os seus conhecimentos sobre as reações catalisadas por enzimas com as leis reconhecidas pela química física. A Henri é atribuído o mérito de ter sido o primeiro a escrever a equação que agora se conhece como equação de Michaelis-Menten. Usando a glicose e a frutose nas reações catalíticas controladas pela maltase e a invertase, Leonor Michaelis foi o primeiro cientista a distinguir os diferentes tipos de inibição usando a escala de pH, que não existia nos tempos de Henri. Durante o seu trabalho de descrição da velocidade desta reação, eles também testaram e extrapolaron a ideia do cientista Victor Henri de que essa enzima que estavam a usar tinha alguma afinidade por ambos os produtos desta reação: frutose e glicose. Usando os métodos de Henri, Michaelis e Menten aperfeiçoaram este conceito do método da velocidade inicial para as experiências de estado estacionário. Estudaram a inibição e descobriram que a inibição não-competitiva (mista) se caracteriza pelo seu efeito sobre a kcat (velocidade do catalisador), enquanto a competitiva se caracteriza pelo seu efeito sobre a velocidade (V). As experiências de Michaelis e Menten centraram-se principalmente nos efeitos do pH na invertase usando iões hidrogénio. A invertase é uma enzima encontrada em extratos extracelulares de leveduras que catalisava uma reação por hidrólise ou invertia a sacarose a “açúcar invertido.” A razão principal para usar a invertase era que, com esta, podiam fazer-se ensaios facilmente e as experiências podiam realizar-se com maior rapidez. A sacarose comporta-se nos polarímetros como dextrorrotatória ou D, enquanto o açúcar invertido é levorrotatória ou L. Isto fazia com que rastrear a inversão do açúcar fosse relativamente simples. Também descobriram que nas reações catalisadas pela invertase se libertava α-D-glicose, a qual é muito instável e muda espontaneamente para β-D-glicose. Embora estejam ambas na forma dextrorrotatória, foi por isto que eles se aperceberam de que a glicose pode mudar espontaneamente, o que se chama mutarrotação. O facto de isto não ter sido tido em conta anteriormente foi uma das principais razões para que as experiências de Henri ficassem aquém das expectativas. Usando a invertase para catalisar a inversão da sacarose, podiam ver a rapidez com que a enzima estava a reagir por polarimetria; portanto, puderam comprovar que a inibição não-competitiva ocorria na reação na qual a sacarose era invertida pela invertase.
Terminologia É importante notar que, embora todos os inibidores não-competitivos se liguem à enzima em sítios alostéricos (ou seja, localizações distintas do seu sítio ativo), nem todos os inibidores que se ligam a um sítio alostérico são inibidores não-competitivos. De facto, os inibidores alostéricos podem atuar como inibidores competitivos, não-competitivos ou incompetitivos (acompetitivos). Em certas ocasiões, a terminologia é um pouco confusa, porque muitas fontes continuam a fundir estes dois termos (alostérico, não-competitivo), ou dão uma definição de inibição alostérica como definição de inibição não-competitiva.
Mecanismo
A inibição não-competitiva modela um sistema no qual o inibidor e o substrato podem estar ambos ligados à enzima num dado momento. Quando estão ligados tanto o substrato como o inibidor, o complexo enzima-substrato-inibidor não pode formar o produto e apenas pode converter-se de novo no complexo enzima-substrato ou no complexo enzima-inibidor. A inibição não-competitiva distingue-se da inibição mista geral pelo facto de o inibidor ter uma afinidade igual pela enzima e pelo complexo enzima-substrato. Por exemplo, nas reações catalisadas por enzimas da glicólise, a acumulação de fosfoenolpiruvato é catalizada pela piruvato quinase para formar piruvato. A alanina é um aminoácido que se sintetiza a partir do piruvato e também inibe a enzima piruvato quinase durante a glicólise. A alanina é um inibidor não-competitivo; portanto, liga-se fora do sítio ativo ao substrato para que este continue a ser o produto final. Outro exemplo de inibição não-competitiva é o da inibição pela glicose-6-fosfato da hexoquinase no cérebro. Os carbonos 2 e 4 da glicose-6-fosfato contêm grupos hidroxilo que se ligam juntamente com o fosfato ao carbono 6 do complexo enzima-inibidor. O substrato e a enzima são diferentes nas combinações de grupos às quais o inibidor se liga. A capacidade da glicose-6-fosfato de se ligar em diferentes sítios ao mesmo tempo faz com que seja um inibidor não-competitivo. O mecanismo mais comum de inibição não-competitiva implica a ligação reversível do inibidor a um sítio alostérico, mas é possível que o inibidor funcione por outros meios, como pode ser a ligação direta ao sítio ativo. Difere da inibição competitiva pelo facto de a ligação do inibidor não impedir a ligação do substrato, e vice-versa, mas simplesmente impedir a formação do produto durante um período de tempo limitado.
Este tipo de inibição reduz a velocidade máxima de uma reação química sem mudar a afinidade de ligação aparente do catalizador pelo substrato (Kmap ; ver cinética de Michaelis-Menten). Quando se adiciona o inibidor não-competitivo, a Vmax muda, enquanto a Km permanece inalterada. De acordo com a gráfica de Lineweaver-Burk, a Vmax reduz-se durante a adição de um inibidor não-competitivo, o que é mostrado na gráfica por uma mudança na pendente e no ponto de interceção com o eixo Y quando se adiciona um inibidor não-competitivo. A diferença primária entre a inibição competitiva e a não-competitiva é que a competitiva afeta a capacidade do substrato de se ligar a um inibidor em vez do substrato, o que diminui a afinidade da enzima pelo substrato. Na inibição não-competitiva, o inibidor liga-se a um sítio alostérico e impede que o complexo enzima-substrato realize a reação química. Isto não afeta a Km (afinidade) da enzima (pelo substrato). A inibição não-competitiva difere da incompetitiva porque permite que o substrato se ligue ao complexo enzima-inibidor e forme um complexo enzima-substrato-inibidor, o que não acontece na inibição incompetitiva, a qual impede que o substrato se ligue ao inibidor da enzima por meio de uma mudança conformacional por ligação alostérica.
Equação Na presença de um inibidor não-competitivo, a afinidade aparente da enzima equivale à afinidade real. Em termos da cinética de Michaelis-Menten, Kmap = Km. Isto pode ser considerado uma consequência do principio de Le Chatelier porque o inibidor se liga igualmente tanto à enzima como ao complexo enzima-substrato para que o equilíbrio se mantenha. No entanto, como algumas enzimas estão sempre inibidas e não convertem o substrato em produto, a concentração efetiva da enzima diminui. Matematicamente,
V
m a x
a p
=
V
m a x
1 +
[ I ]
K
I
{\displaystyle V_{max}^{ap}={\frac {V_{max}}{1+{\frac {[I]}{K_{I}}}}}}
a p a r e n t e
[ E
]
0
=
[ E
]
0
1 +
[ I ]
K
I
{\displaystyle {aparente\ [E]_{0}}={\frac {[E]_{0}}{1+{\frac {[I]}{K_{I}}}}}}
Exemplo: inibidores não-competitivos da enzima CYP2C9 Inibidores não-competitivos da enzima CYP2C9 são a nifedipina, a tranilcipromina, o fenetil isotiocianato e a 6-hidroxiflavona. As simulações por computador e os mutantes substituídos construídos indicam que o sítio de ligação não-competitiva da 6-hidroxiflavona é o sítio de ligação alostérico da enzima CYP2C9.
Notas
Referências
